l、4ml肝素抗凝血于離心管中，加入2ml RPMI 1640。
2、混勻后沿管壁緩慢加到預置有4ml淋巴細胞分離液的液面上靜置30min。
3、1500rpm，15min，吸取白細胞層（第二層）于另一離心管中。
4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細胞兩次。
5、將白細胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入10μl環(huán)胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混勻。
6、水浴搖床，40次/分，37℃，3hr。
7、1500rpm，15min。將細胞接種至1ml培養(yǎng)基中（內(nèi)含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl環(huán)胞霉素，輕輕混勻，37℃培養(yǎng)。
8、5天后觀察細胞轉(zhuǎn)化和生長情況，決定是否半量換液。一般半量換液l—2次，并維持環(huán)胞霉素的濃度。
9、待轉(zhuǎn)化細胞數(shù)量明顯上升，并出現(xiàn)細胞團塊后，可轉(zhuǎn)入25ml細胞培養(yǎng)瓶中，加1—2ml培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)10—15天，一般每隔3—4天觀察一次，決定是否換液，傳代。
10、細胞生長達一定數(shù)量后凍存，凍存前應進行核型分析和存檔。